Стр. 165 - Северин С.Е. (ред.) Биологическая химия с упражнениями и зад

Упрощенная HTML-версия

162
Модуль
3.
Матричные биосинтезы
Клонированне ДИК. Методика клонирования и размножения рекомби­
нантноА ДН К в бактериях позволяет получить интересующие нас nродук­
ты: ДН К, РН К ил и белки в достаточно больших количествах (рис.
3.28).
Бактериофаги, бактериальные плазмилы
-
экстрахромосомные кольцевые
ДНК- используются в качестве векторов, с nомощью которых чужеродный
ген вносится в бактерию, где обесnечивается его репликация , транскриnция
и трансляция с образованием нужного белкового nродукта.
Полимеразная цепная peaКIUfя (ПЦР) - метод амплификации , т.е. nолу•r с­
ния большого числа копий интересующего нас гена или его фрагмента в услови­
ях
in vitro.
Реакционная смесьдля получения интересующей нас ДНК содержит:
исследуемую ДН К-матрицу, субстраты реакции- четыре дНТФ (дАТФ, дГТФ,
дТТФ, дЦТФ), два праймера, термастабильную Таq-полимеразу и реакционный
буфер, содержащий ионы
Mg
2
+
в качестве кофактора.
Праймеры
-
это искусственно синтезированные короткие одновитевые
ДН К
(20- 30
нуклеотидов), выполняющие функцию «затравок•> nри фер­
ментативном синтезе ДНК. В ПЦР обычно исnользуют два праймера , кото­
рые ком племснтарн ы
3
'-концевым последовательностям ам пл ифи ци руемого
у•r астка на обеих нитях ДНК-матрицы соответственно. Кон центрация прай­
меров знач ительно превышает кол и чество ДН К-матрицы в реа кционной
смеси. Расстояние между nраймерами оnределяет длину синтезируемых в
П ЦР фрагментов ДН К.
В один цикл ПЦР включается три этапа (рис.
3.29):
денатурация - исходная смесь нагревается до
94
·с, nри этом имеет место
разрушен ие двуспиральной структуры ДНК и расхождение цепей ;
отжиг - на этом этапе темnература реакционной смеси снижается до
52-60
·с и nроисходит комплементарное связывание nраймеров с нитями
матричной ДНК;
полимеризация , в ходе которой Таq-пол имераза катализирует удли не­
ние nраймеров (с 3'-кон ца) и синтез новых цеnей ДНК . Темnература
смеси для nроя вления оптимальной активности Таq-nолимеразы соот­
ветствует
72
·с.
Эти этапы поеторя ются м ногократно в автоматическом nриборе -ам пли­
фикаторс (термоuиклере), что nозволяет nол у•1ить огромное количество
копий юrтересующего нас фрагмента ДНК. Так , в результате nроведения
20
циклов П Ц Р анализируемый участок ДН К амnл ифи цируется более чем в
милл ион раз. Продолжительность каждого этапа uикла ПЦР оnределяется
экспериментально и обыч нодлится
1-2
минуты.
Механизм образования рекомбинантных ДНК дает возможность:
использовать микроорr·анизмы в качестве nродуцентов необходи мых
дл я человека веществ: белковых гормонов (инсулин , гормон роста,
соматостатин), биологически активных пептидов, вакцин (наnример,
nротив гепатита С), факторов , участвующих в свертывании крови (фак­
тор
Vll 1
для лечения гемофилии);
создавать новые nолезные для человека формы растен ий и животных ;
предnринимать nоn ытки лечения наследственных болезней nутем вве­
дения в клетки нормальных копий дефектных генов.