Роль апоптоза в патогенезе заболеваний.

Апоптоз в многоклеточном организме.

Проблема исследования молекулярных механизмов запрограммированной гибели клетки стала в последние годы одной из самых трудных и актуальных проблем биологических наук. Трудность этой проблемы, очевидна: несмотря на большое количество экспериментальных данных, до сих пор остаются нс исследованными механизмы этого явления, не до конца выяснена регуляция апоптоза отдельных клеток в целостном многоклеточном организме. Актуальность этой проблемы определяется взаимосвязью нарушения регуляции процесса запрограммированной гибели клетки с большинством заболеваний. Выявление конкретных механизмов нарушения регуляции апоптоза, сопровождаемых конкретными заболеваниями, позволит определить этиологию и патогенез данных заболеваний. И как следствие этого - возможность коррекции нарушения регуляции запрограммированной гибели клетки.

Для запрограммированной гибели клетки закрепился термин - апоптоз (от греческого apoptosis -опадание). По-видимому, явление апоптоза в эволюции появилось с появлением многоклеточных организмов для регуляции численности клеток и установлению определенных взаимоотношений между отдельными клетками в целостном организме. Эукариотические клетки - это "общественные" существа. Для их развития необходим контакт с себе подобными. Взаимоотношение клеток друг с другом в многоклеточном организме давно привлекают исследователей. И это не случайно, т.к. именно благодаря этому, клетки вступают на стадии жизненного пути, такие как деление, рост, развитие, дифференцировка и, как это выяснилось совсем недавно - на путь гибели клетки. Следует заметить, что проблеме гибели клетки учеными уделялось значительно меньше внимания, чем другим этапам жизненного пути клетки. И это, не смотря на то, что первые высказывания о существовании процесса гибели клеток в многоклеточном организме появились еще в конце XIX. Однако годом признания апоптоза как физиологического явления, считается 1972 год, когда английские исследователи Kerr, Wyllie, Currie представили убедительные морфологические доказательства существования этого явления.

Примеры апоптоза клеток в организме.

В процессе онтогенеза и эмбриогенеза.

Апоптоз играет жизненно важную роль в процессе эмбрионального и онтогенетического развития. Он наблюдается при различных морфогенетических процессах.

Хорошо исследована апоптотическая гибель клеток при эмбриональном развитии беспозвоночных животных, например нематоды (Chaenorhabditis elegans). Запрограммированная клеточная гибель наблюдается при метаморфозе насекомых. Изучена также запрограммированная клеточная гибель в процессе эмбриогенеза высших позвоночных - при развитии глаза млекопитающих, сердца, нервной системы. Нарушение апоптоза в эмбриогенезе может приводить к внутриутробной гибели плода, врожденным уродствам или различным заболеваниям, в том числе и злокачественным новообразованиям.

В тканях взрослого организма.

Во взрослом организме апоптоз распространен в различных типах тканей. Он встречается как в медленно пролиферирующей популяции клеток (гепатоциты, клетки эпителия коры надпочечников), так и в быстро пролиферирующих клеточных популяциях. В первом случае он выполняет функцию гомеостатической регуляции оптимального объема ткани. Во втором случае роль апоптоза, в основном, связана с дифференцировкой клеток.

При патологических состояниях.

Апоптотическая гибель клеток наблюдается при различных патологических состояниях. Этим путем осуществляется гибель клеток в эндокринно-зависимых тканях, при уменьшении концентрации соответствующего гормона (например, клеток простаты после кастрации и коры надпочечников после подавления синтеза АКТГ глюкокортикоидами). Гибель клеток путем апоптоза происходит также при уменьшении кровоснабжения органа (ишемическая болезнь сердца).

Путем программированной клеточной гибели происходит удаление клеток, выживание которых нежелательно для организма, например мутантных клеток или клеток, зараженных вирусом. В последнем случае этот процесс имеет важное биологическое значение, поскольку фрагментация ДНК предупреждает перенос генетического материала в другие клетки.

Воздействие радиации вызывает апоптоз в пролиферирующих клетках эпителия кишечника и в непролиферирующих клетках иммунной системы.

Т.е. апоптоз является широко распространенным общебиологическим механизмом, ответственным за поддержание постоянства численности клеток, формообразование, выбраковку дефектных клеток.

Различные пути гибели клетки.

Апоптоз как явление впервые был описан морфологами. Основываясь на микроскопической картине гибнущей клетки, они установили, что клетки погибают, по крайней мере, двумя путями: некроз и апоптоз. При некрозе клетки набухают, их митохондрии и другие органеллы расширяются (вследствие нарушения работы ионных каналов) и разрываются внутриклеточные и плазматическая мембраны клетки:

В результате этого активируются лизосомальные ферменты, а внутриклеточное содержимое, попадая во внеклеточную среду, вызывает воспалительные процессы. Классические причины, приводящие к некрозу клетки -гипертермия, ингибирование окислительного фосфорилирования, гликолиза или цикла Кребса, гипоксия, действие комплемента или различных токсинов.

Отличительной морфологической чертой апоптоза является коллапс ядра. Хроматин, который в норме представлен открытыми и конденсированными областями (гетеро- и эухроматин), становится суперконденсированным в форме полумесяца по периферии ядра. В этот момент начинается фрагментация ДНК. На ранних стадиях апоптоза, в отличии от некроза, клетка наоборот, сморщивается, теряя до 1/3 своего объема за несколько минут. Механизм этого явления до сих пор не изучен, но, несомненно, в этот процесс должны вовлекаться транспорт ионов и воды. Важной особенностью этого процесса является то, что не происходит повреждения мембран клетки. Усыхание хорошо выражено как в культуре клеток, так и в тканевых срезах, где апоптотическая клетка отделяется от соседних клеток. Далее апоптотическая клетка превращается в совокупность окруженных мембраной апоптозных телец различных по своему составу, которые фагоцитируются макрофагами или соседними клетками. Клетка на данном этапе еще живая (включение летального красителя трипанового синего не происходит). Видимо в этом и есть задача апоптоза - утилизация еще живых апоптозных телец, пока содержимое клетки не попадает во внеклеточную среду, не вызывая воспалительных явлений. Т.е. уничтожение клеток путем апоптоза обеспечивает минимальное повреждение тканей по сравнению с другими механизмами смерти.

Причины апоптоза.

Феномен апоптоза является результатом действия различных факторов, приводящих к гибели клетки:

Это могут быть неспецифические факторы, такие как температура, токсические агенты, оксиданты, свободные радикалы, гамма- и УФ- излучение, бактериальные токсины и др. Во всех этих случаях происходит индукция апоптоза, но при увеличении дозы соответствующего агента развивается некроз клетки. Поскольку апоптоз физиологическое явление, то в организме должны быть факторы, приводящие к апоптозу клетки. К настоящему времени известно, что апоптоз могут вызывать как внутриклеточные сигналы, так и внешние, опосредующие свое действие через рецепторные системы, которые сами по себе не являются токсическими или деструктивными. В целом, если идет речь о физиологических факторах, то следует применять термин регуляция апоптоза клетки, поскольку известна группа физиологических активаторов и ингибиторов апоптоза. Физиологические регуляторы апоптоза клетки вызывают повышенный интерес исследователей. В первую очередь рассмотрим регуляцию апоптоза клеток гормонами. В эндокринологии давно известно, что удаление эндокринной железы приводит к массовой инволюции клеток-мишеней. Механизм этого явления долго не был известен, и только открытие явления апоптоза дало толчок к изучению процессов, лежащих в основе действия гормонов на жизнеспособность клеток. Так, кастрация приводит к атрофии железистых клеток простаты.

Введение андрогенов предотвращает этот процесс. Т.е. андрогены являются ингибиторами апоптоза для клеток простаты. В тоже время они являются индукторами апоптоза для фолликулярных клеток яичника. На данном примере можно видеть, как одни и те же гормоны являются ингибиторами апоптоза для одних клеток и индукторами апоптоза для других. Также изучено противоположное действие по регуляции апоптоза одним и тем же гормоном в зависимости от стадии дифференцировки клетки. Так эстрогены являются ингибиторами апоптоза эпителия матки в начале менструального цикла и индуктором апоптоза - в конце цикла. Ингибитором апоптоза эпителия матки в конце цикла будут прогестерон. На примере половых гормонов мы рассмотрели физиологическую регуляцию апоптоза клеток в зависимости от типа клеток и стадии их дифференцировки. Центральное место в исследовании апоптогенного действия гормонов принадлежит изучению влияния глюкокортикоидов (ГК) на лимфоидные клетки.

Чувствительность незрелых тимоцитов к ГК- индуцированному апоптозу характерна для многих биологических видов, в том числе для человека, грызунов и птиц. Чувствительность Т-клеток к ГК зависит от стадии развития лимфоцитов. Пре-Т-клетки костного мозга и незрелые Т-клетки тимуса чувствительны к физиологическим дозам ГК. Ранее считалось, что зрелые модулярные тимоциты и периферические лимфоциты резистентны к ГК. Однако недавно было показано, что определенные субпопуляции зрелых Т-лимфоцитов (натуральные киллеры, цитотоксические Т-лимфоциты) претерпевают апоптоз под действием ГК. В- клетки также чувствительны к ГК в зависимости от стадии своего развития. Пре- В- клетки и незрелые В- клетки гибнут путем апоптоза под действием ГК. Зрелые В- лимфоциты нечувствительны к ГК.

Действие гормонов опосредовано внутриклеточными специфическими рецепторами (для данных приведенных примеров). Рецептор, связывая лиганд, регулирует транскрипцию гормоночувствительных генов. Это могут быть гены, продукты которых регулируют продвижение клетки по клеточному циклу или апоптоз- специфические гены. Другими важными физиологическими регуляторами апоптоза являются цитокины. Цитокины - это обширная группа белков, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток при связывании со специфическими рецепторами на клетках мишенях. В отличие от гормонов, цитокины действуют, в основном, на пара- и аутокринном уровне. Цитокины подразделяются на 3 большие группы (в зависимости от структуры и функции): ростовые факторы (колониестимулирующие факторы, эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста и т.д.), семейство Фактора некроза опухоли (ФНО) и спиральные цитокины (интерлейкины, интерфероны). Эффект цитокинов на клетки также неоднозначен: для одних клеток они выступают в роли индуктора апоптоза, для других - в роли ингибитора апоптоза. Это зависит от типа клетки, от стадии ее дифференцировки, от функционального состояния клетки.

Наиболее хорошо изучена последовательность событий, приводящих клетку к апоптозу в результате взаимодействия белков из семейства ФНО со специфическими рецепторами. Ярким представителем этой группы белков является система Fas/Fas-L. Следует отметить, что для этой системы не известны другие функции, кроме как индукции апоптоза клетки. Fas/APO-l/CD-95 -рецептор, по структуре, относящийся к рецепторам семейства ФНО. Взаимодействие Fas с Fas-L (лиганд) или с моноклональными антителами приводит к апоптозу клетки. Fas конститутивно экспрессируется на поверхности клеток многих типов: на тимоцитах, лимфобластоидных клеточных линиях, активированных Т- и В- лимфоцитах, а также на фибробластах, гепатоцитах, кератиноцитах, миелоидных клетках. Человеческий Fas состоит из 325 аминокислотных остатков и относится к мембранным белкам I типа. Т.е. в его структуре можно выделить внеклеточный, трансмембранный и цитоплазматический домены. Гомология аминокислотной последовательности среди рецепторов семейства ФНО высока. Примерно 80 аминокислотных остатков образуют домен смерти (DD), который вовлекается в белок - белковое взаимодействие с цитоплазматическими белками, генерируя сигнал смерти. Ген Fas у человека локализован в длинном плече хромосомы 10 и состоит из 9 экзонов.

Fas-L является цитокином и относится к семейству цитокинов ФНО. Fas-L экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и натуральных киллерах, а также на клетках Сертоли и паренхимных клетках передней камеры глаза, что позволяет этим клеткам убивать любую Fas- экспрессирующую клетку, в том числе и активированный Т-лимфоцит. Этот механизм определяет появление защищенных от иммунной системы мест. Fas-L существует в двух формах - нерастворимой или мембраносвязанной и растворимой, отщепляемой от клетки с помощью металлопротеиназы. Растворимая форма человеческого Fas-L сохраняет свою активность. Подобно другим лигандам рецепторов семейства ФНО, Fas-L - гомотример связывается с 3 молекулами Fas.

При связывании лиганда с рецептором происходит олигомеризация цитоплазматических белков: (1) DD (домен смерти), относящийся к рецептору, (2) адапторного белка - FADD (Fas-ассоциированный домен смерти), содержащий DED - эффекторный домен смерти и (3) прокаспазы-8:

В результате этого процесса происходит активация апоптоз-специфической протеазы - каспазы-8 и развиваются характерные для апоптоза процессы. Мутации в гене fas или в гене fas-L приводят к развитию аутоиммунных заболеваний.

Важная роль в регуляции апоптоза клеток иммунной системы принадлежит другим цитокинам -интерлейкинам, интерферонам. Интенсивно ведутся работы по выяснению апоптогенного действия интерлейкинов (ИЛ). Было обнаружено, что они являются индукторами апоптоза как в здоровых, так и в онкологических клетках и клеточных линиях. Например, ИЛ-12 индуцирует апоптоз натуральных киллеров, ИЛ-4 и ИЛ-10 - периферических моноцитов человека, ИЛ-10 - Т-лимфоцитов. Однако не только роль индукторов апоптоза свойственна интерлейкинам, не менее выраженный эффект цитокинов наблюдается в предотвращении апоптоза. При этом один и тот же ИЛ может быть как индуктором апоптоза, так и его ингибитором. Различия в ответе клеток наблюдаются для разных клеток-мишеней и, возможно, зависят от степени их дифференцировки и развития. Так, например, ИЛ-1 является индуктором апоптоза для клеток мышиной тиомы в случае ингибирования размножения клеток (фаза плато на кривой роста) и ингибитором апоптоза для этих же клеток в случае их интенсивного размножения (фаза роста). ИЛ-2 является ингибитором апоптоза Т-лимфоцитов, В- лимфоцитов. ИЛ-4 также ингибирует апоптоз Т-лимфоцитов и В- лимфоцитов. ИЛ-3, ИЛ-6, ИЛ-9 известны только как ингибиторы апоптоза клеток.

Неоднозначна и роль интерферонов (ИФ) по влиянию на клетки. В одних случаях ИФ вызывает апоптоз (клетки костного мозга), в других - является ингибитором апоптогенного сигнала (периферические моноциты человека).

Интересные данные касаются регуляции апоптоза пептидными ростовыми факторами. Имеются убедительные сведения о том, что факторы роста предотвращают развитие апоптоза в клетках. Удаление факторов роста из культуры клеток приводит к типичным апоптотических проявлениям.

Таким образом, апоптоз является тем механизмом, который обуславливает элиминацию клеток с определенной специфичностью рецепторов. Наличие в организме физиологических факторов -индукторов и ингибиторов апоптоза позволяет сделать вывод, что программированная гибель клетки зависит от соотношения факторов, вызывающих апоптоз и предотвращающих его, а также от регуляторных внутриклеточных механизмов.

Роль протеолиза в развитии апоптоза.

В настоящее время складывается впечатление о центральной роли протеаз в запуске и развитии процесса апоптоза. Причем, по-видимому, при апоптозе, в отличие от физиологического ответа клетки, действуют свои, характерные только для апоптоза, специализированные необратимые реакции протеолиза, катализируемые специфическими протеазами, относящихся к классу цистеиновых протеаз. Эта группа протеаз, названная каспазы (caspases), существует обособленно и функционирует как медиатор сигнала смерти. С - отражает механизм протеолиза. Т.е. в активном центре находится цистеин. Асп - обозначает аспарагиновую кислоту, которая узнается как субстрат, пептидная связь после нее подвергается гидролизу. Аза - окончание, свойственное ферментам. К настоящему времени в различных клетках млекопитающих обнаружено 10 каспаз, образующих ферментативный каскад, подобно ферментативному каскаду свертывающей системы крови или системы комплемента. Каспазы имеют высокую степень гомологии по своей аминокислотной последовательности, схожи по структуре и по субстратной специфичности. Они синтезируются в виде проферментов (30-50 кД), которые содержат 3 домена: N-концевой домен, большую субъединицу (20 кД) и малую субъединицу (10 кД). Во время активации каспазы подвергаются протеолитическому отщеплению N-концевого домена, отличающегося наибольшей вариабельностью как по размерам, так и по аминокислотной гомологии.

Этот процессинг между доменами сопровождается ассоциацией большой и малой субъединицей в гетеродимер с формированием активного центра. Кристаллическая структура двух каспаз (caspase-1 и caspase-3) определена: в обоих случаях гетеродимер ассоциирован в тетрамер с формированием 2 каталитических сайтов:

Среди каспаз различают эффекторы, т.е. ферменты непосредственно гидролизующие структурные белки клетки, и индукторы - каспазы, которые принимают апоптотический сигнал и передают его на эффекторные каспазы. Среди молекулярных мишеней каспаз - эффекторов известны многие белки, деградация которых вызывает развитие необратимых процессов, характерных для апоптоза. Каким образом происходит регуляция активности каспаз в интактной клетке? Каспазы присутствуют в клетке конституционно (даже в нейронах, которые не обновляются на протяжении всей жизни), что позволяет индуцировать апоптоз быстро. Один из путей активации каспаз связан с взаимодействием индуктора апоптоза со специфическими рецепторами (например, активация каспазы-8 при взаимодействии Fas - лиганда с Fas-рецептором). Другой путь - активация каспазы-9 в результате образования гетеродимеров белками семейства Вс1-2 (будет рассмотрено далее). Третий путь активации каспаз - при помощи гранзимов В - сериновой протеазы. Такой путь активации каспаз актуален в случае индукции апоптоза клетки цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые и секретируют эти ферменты. При таком способе активации каспаз необходимо присутствие порообразующих белков перфоринов, продуцируемых также цитотоксическими Т-лимфоцитами. В качестве мишеней гранзимов В известны каспазы 1, 3 и 9.

Апоптоз-специфическая фрагментация ДНК.

Одно из апоптотических событий реализуется в ядре клетки и заключается в фрагментации ДНК. Деградация ДНК является терминальной фазой апоптоза. В ходе деградации ДНК сначала происходит образование крупных фрагментов, содержащих примерно 300 тыс. пар оснований (п.о.), несколько позже - 30-50 тыс.п.о. Далее наступает следующий этап фрагментации ДНК - ее межнуклеосомная деградация, с формированием фрагментов, содержащих 180 пар оснований (протяженность нити ДНК в нуклеосоме) или кратных им по величине. Именно эти фрагменты выявляются в виде "лесенки" при электрофорезе ДНК лизатов апоптотических клеток, который широко используется для идентификации апоптоза. Такая фрагментация ДНК связана с протеолитическим расщеплением специфического белка топоизомеразы II. Это белок выполняет структурную и ферментативную функции и участвует в формировании структур ДНК высшего порядка - суперспирализованных петель. Они содержат по 50 тыс. п.о. Шесть петель, объединенных в единую дисковидную розетку, образуют еще более сложную структуру и имеют в своем составе соответственно по 300 тыс. п.о. Следует напомнить, что именно на фрагменты по 50 и 300 тыс. п.о. расщепляется ДНК в начальной стадии деградации при апоптозе. Деградация топоизомеразы II каспазами является одной из причин фрагментации ДНК.

Также субстратом протеаз при апоптозе является гистон H1, который защищает ДНК от действия эндонуклеаз на межнуклеосомальном уровне. В результате этого расщепления происходит деградация ДНК на фрагменты порядка 180 п.о. и кратные им.

Осуществление различных этапов деградации ДНК связывают с проявлением активности различных эндонуклеаз. Мало сведений о характеристике эндонуклеаз, обусловливающих появление крупных фрагментов ДНК. Немногим больше сведений о процессах межнуклеосомальной деградации ДНК, в результате которой образуются фрагменты ДНК размером 180 п.о. Считают, что этот тип деградации обеспечивается активацией Са2+, Mg2+-зависимой эндонуклеазы.

Механизмы индукции апоптоза при повреждении ДНК.

До последнего времени считалось, что нерепарируемые повреждения ДНК приводят клетку к гибели в результате нарушения функций всех биохимических систем из-за невозможности полноценной транскрипции генов, содержащих дефекты в матрице ДНК. Исследования последних лет привели к формированию принципиально новых представлений о механизме гибели клеток, имеющих повреждения ДНК, как о процессе, осуществляемом в соответствии с определенной генетической программой. В индукции этой программы при наличии повреждений в ДНК клетки важная роль принадлежит белку р53. Этот белок с молекулярной массой 53 кД локализован в ядре клетки и является одним из транскрипционных факторов, повышенная экспрессия которого приводит к репрессии ряда генов, регулирующих транскрипцию и причастных к задержке клеток в фазе клеточного цикла G1. При повреждении ДНК под действием ионизирующего излучения или УФ- излучения, ингибиторов топоизомеразы II и некоторых других воздействиях происходит активация экспрессии гена р53. Блок клеточного цикла в фазах G1 и G2 до репликации ДНК и митоза, соответственно, делает возможной репарацию поврежденной ДНК и предотвращает тем самым появление мутантных клеток. Если же активность репарационных систем недостаточна и повреждения ДНК сохраняются, то в таких клетках индуцируется программируемая клеточная гибель, или апоптоз, что приводит к защите организма от присутствия клеток с поврежденной ДНК, т.е. мутантных и способных к злокачественной трансформации.

На уровне транскрипции р53 регулирует экспрессию генов, участвующих в блокаде клеточного цикла - р21 (ингибитор большинства циклин- зависимых киназ, либо взаимодействует либо с комплексами, определяющими синтез и репарацию ДНК, либо с белками, модулирующими апоптоз - Вах. Последовательность рассмотренных событий представлена на рисунке:

Мутации гена р53 позволяют таким клеткам сохранять жизнеспособность в митозе, что чревато выживанием клеток, подвергшихся опухолевой трансформации. И действительно, при онкологической трансформации обнаружено значительное количество мутаций гена р53. Мутации гена р53 связаны с плохим прогнозом в лечении злокачественных новообразований. Такие опухолевые клетки оказываются резистентными к лучевой и химиотерапии. И, наоборот, опухоли с нормальным (диким типом) р53 - легко поддаются лечению.

Таким образом, при действии генотоксических агентов р53 не только увеличивает время репарации ДНК. но также защищает организм от клеток с опасными мутациями. Блокирование процесса апоптоза, происходящее на разных стадиях канцерогенеза, приводит к снижению способности трансформированных клеток активировать программу клеточной гибели, что определяет прогрессию опухолевого заболевания.

Роль белков семейства Вс1-2 в регуляции апоптоза клетки.

Процесс регулированной клеточной гибели условно может быть разделен на несколько различных фаз: фаза инициации апоптоза, проведение сигнала, активация каспаз, активация эндонуклеаз и специфическая деградация ДНК, в результате чего наступает гибель клетки.

Если начальные фазы различаются в зависимости от типа клеток и от апоптоз- индуцирующего сигнала, то этап деградации ДНК - универсален для большинства клеток. Эта фаза является переходом к необратимой - терминальной стадии апоптоза, которую контролируют белки семейства Вс1-2, производные одноименных генов:

В связи с этим, выяснение роли белков семейства Вс1-2 занимает центральное место в изучении регуляции процесса апоптоза. К настоящему времени известно, что белки этого семейства относятся либо к индукторам апоптоза (Bad, Bax, Bcl-Xs, Bik, Bid, Bak), либо к ингибиторам (Bcl-2, Bcl-XL). Белки семейства Bcl-2 находятся в постоянном динамическом равновесии, образуя гомо- и гетеродимеры, что в конечном счете влияет на развитие апоптоза клеток. Поэтому считается, что соотношение активных форм этих белков определяют реостат жизни и смерти клетки. Механизм регуляции этого процесса целесообразно рассматривать с позиции структурно-функциональных взаимоотношений между белками этого семейства, которые позволяют объединить их в одно семейство - белков семейства Bcl-2.

Пути активации белков семейства Bcl-2.

К настоящему времени показано, что решающим моментом в запуске апоптоза является гетеродимеризация белков семейства Bcl-2 - индукторов и ингибиторов апоптоза. Каким же образом белки семейства Bcl-2 получают сигнал к регуляции апоптоза от этих рецепторов? К настоящему времени изучена способность модулировать состояние белков семейства Bcl-2, по крайней мере, 3 различными механизмами.

Первый механизм связан с изменением структуры белка - индуктора апоптоза -Bad, а именно его степени фосфорилирования / дефосфорилирования:

Осуществляется этот механизм через рецептор интерлейкина-3 (ИЛ-3). ИЛ-3, связываясь со специфическим рецептором, активирует специфические киназы, которые осуществляют фосфорилирование Bad, что увеличивает его сродство к цитоплазматическому белку. При этом не происходит образование гетеродимера Bcl-2/Bad и апоптоз не развивается. В отсутствии ИЛ-3 активируются фосфатазы, что приводит к дефосфорилированию Bad, образованию гетеродимеров Bcl-2/Bad и запуску процесса апоптоза за счет высвобождения митохондриальных факторов. Недавно установили, что таким фактором является цитохром С, а также апоптоз- индуцирующий фактор, который, по-видимому, является протеазой. Высвобождение этих факторов приводит к распаду комплекса Bcl-2/ Apaf-1/ неактивная каспаза-9, что приводит к активации каспазы-9.

Другой механизм регуляции функционального состояния белков семейства Bcl-2 также связан с фосфорилированием / дефосфорилирование белков -индукторов апоптоза посредством киназы Raf-1, активируемой через специфические Raf-1 рецепторы с участием G-белка - Ras:

При поступлении специфического апоптогенного сигнала происходит фосфорилирование белка Вах, что уменьшает его способность образовывать гетеродимеры с Bcl-2, в результате чего происходит ингибирование апоптоза. Третий механизм возможного ингибирования белка Bcl-2 связан с полученными недавно данными, касающимися белка Bag-1. Белок Bag-1 способен взаимодействовать с Bcl-2 и с цитоплазматическим доменом рецептора для гепатоцеллюлярного фактора роста и тромбоцитарного фактора роста. При отсутствии в среде этих факторов Bag-1 связан с Bcl-2. При взаимодействии этих факторов со специфическими рецепторами, Bag-1 взаимодействует с цитоплазматическим доменом этого рецептора, освобождая Bcl-2, что приводит к апоптозу. Вероятно, существует достаточно много способов регулировать на клеточном уровне функциональную активность белков семейства Вс1-2 как ингибиторов, так и индукторов апоптоза посредством определенных сигналопередающих молекул и путей, активируемых ими. Учитывая функциональную важность белков семейства Bcl-2 в регуляции такого сложного и многостороннего процесса, как апоптоз, можно утверждать, что эти белки являются перспективной мишенью для различных манипуляций с целью воздействия на желаемую судьбу клетки.

Терапия на основе апоптоза.

Таким образом, апоптоз является общебиологическим механизмом, ответственным за поддержание постоянства численности клеточных популяций, а также формообразование и выбраковку дефектных клеток. Нарушение регуляции апоптоза приводит к возникновению различных заболеваний, связанных с усилением или, наоборот, ингибированием апоптоза. Следовательно, изучение механизмов регуляции различных этапов данного процесса позволит определенным образом воздействовать на его отдельные этапы с целью их регуляции или коррекции. В настоящее время общепринято: если клетка погибает от апоптоза - подразумевается возможность терапевтического вмешательства, если вследствие некроза - нет. На основе знаний о программированной гибели клетки используется широкий ряд препаратов с целью регуляции этого процесса в различных типах клеток. Так, сведения о рецептор- опосредованной регуляции апоптоза клеток позволяют использовать их для терапии гормон- зависимых новообразований. С использованием андроген- блокирующей терапии лечат рак простаты. Рак молочной железы часто подвергается регрессии при применении антагонистов эстрогеновых рецепторов. Информация о биохимических сигнал- передающих путях регуляции апоптоза позволяет эффективно применять антиоксидантную терапию, а также использовать препараты, регулирующие концентрацию кальция, либо активирующие (ингибирующие) различные протеинкиназы, с целью коррекции апоптоза в различных типах клеток. Осознание роли апоптоза в гибели клеток интенсифицировало поиск фармакологических средств, защищающих их от апоптоза. Активно изучаются ингибиторы специфических протеаз в качестве фармакологических агентов. Это, как правило, три- или тетрапептиды, содержащие аспарагин. Ограничением их терапевтического использования является их низкая способность проникать в клетку. Однако, несмотря на это, в экспериментах in vivo получены успешные результаты при использовании N-бензилокси-карбонил-Vа1-А1а-Аsр-фторметилкетона ингибитора различных каспаз для снижения зоны инфаркта при моделировании инсульта. В ближайшие годы можно ожидать появления новых лекарственных препаратов для лечения и предупреждения различных заболеваний, в основе действия которых будет заложен принцип регуляции процессов апоптоза.

Многообещающими являются также подходы, связанные с регуляцией апоптоз- специфических генов и реализующиеся, в частности, в генной терапии - одной из самых перспективных областей современной медицины - при лечении заболеваний, вызванных нарушением функционирования отдельных генов. Идентификация морфологических и биохимических маркеров апоптоза должна в перспективе способствовать более глубокому пониманию механизмов патогенеза заболеваний, улучшению дифференциальной диагностики и созданию принципиально новых направлений терапии.

Рекомендованная литература.

1. Программированная клеточная гибель, под ред. Новикова B.C., Санкт-Петербург "Наука", 1996.

2. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология 1996, т. 6, с. 10-23.

3. Уманский С.Р. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы // Молекулярная биология, 1996, том. 30. вып. 3, с. 487-502.

4. Лушников Е.Ф., Загребин В.М. Апоптоз клеток: морфология, биологическая роль, механизмы развития // Архив патологии, 1987, т.49, с. 84-89.

5. Белушкина Н.Н., Хасан Хамад Али, Северин С.Е. Молекулярные основы апоптоза // Вопросы биол. мед. и фарм. химии 1998, №4, с. 15-23.

6. Нестерова М.В,, Чо-Чанг Ю.С., Северин Е.С. Роль антисмысловых олигонуклеотидов в регуляции клеточных процессов // Вопросы биол. мед. и фарм. химии 1998, №4, с.3-14.

7. Аббасаова С.Г., Липкин В.М., Трапезников Н.Н. Кушлинский Н.Е. Система Fas-FasL в норме и при патологии // Вопросы биол. мед. и фарм. химии 1999, №3, с.3-16.

8. Вопросы биол. мед. и фарм. химии 1999, №4 посвящен проблеме генной терапии.

9. Arends M.J., Wyllie A.H. Apoptosis. Mechanism and role in patology // Intern.Rev.Exp.Pathol., 1991, v.32, p.223-254.

10. Magno G., Joris I. Apoptosis, oncosis, necrosis // Amer. J.Pathol. 1995, v.146, N,1, p.3-15. 1. Abastado J.-P. Apoptosis: function and regulation of cell death // Res.Immunol. 1996, v.l47,p.443-456.

11. Pan H., Yin C., Dyke T.V. Apoptosis and cancer mechanisms // Cancer Surveys 1997, v.29, p.305-327 .

Copyright Белушкина Н.Н. © 1999-2002