Стр. 94 - biohimia

Упрощенная HTML-версия

Биологическая химия
94
фрагментируют одной и той же рестриктазой с образованием «липких» концов
(рис. 3.28). После денатурации молекул нагреванием и последующего медленно-
го охлаждения («отжига») ДНК ренативирует, и наряду с исходными молекула-
ми за счет «липких» концов получаются рекомбинантные молекулы, состоящие
из участков ДНК человека и плазмиды (вируса). Эти участки сшивают ДНК-
лигазой, и гибридную плазмиду (вирус) вводят в бактериальные клетки. При вы-
ращивании трансформированных бактерий в культуре экспрессируются «чужие»
гены, и из бактериальной массы можно получить значительные количества инте-
ресующей нас ДНК, мРНК и белка.
Для получения рекомбинантных ДНК кроме фрагментов ДНК, выделенных
из клеток тканей, используют ДНК, синтезированную с помощью
обратной
транскриптазы
или РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Фермент по принципу
комплементарности катализирует синтез ДНК из четырех дНТФ на матрице
мРНК. Продукт реакции — ДНК, не содержащая интронов, в отличие от участ-
ков ДНК из ядерного материала клеток эукариотов.
Фрагменты ДНК длиной в несколько сотен нуклеотидных пар можно ампли-
фицировать с помощью ПЦР в условиях in vitro (в пробирке). Для проведения
ПЦР нужно знать нуклеотидную последовательность концевых участков фраг-
мента. В соответствии с этим химическим путем синтезируют два праймера —
одноцепочечных олигодезоксинуклеотида, состоящих из 15–30 нуклеотидов, и
комплементарных 3’-концам обеих нитей копируемой ДНК-матрицы.
Реакционная смесь для получения копий содержит:
– матрицу — ДНК, выделенную из исследуемого образца;
– субстраты — 4-е дНТФ;
– фермент — термостабильную ДНК-полимеразу (Taq- полимеразу);
– два праймера;
– буфер для создания оптимального рН и ионыМg
2 +
, являющиеся кофакто-
ром Taq-полимеразы;
Праймеры ограничивают участок ДНК, который должен быть амплифици-
рован. Каждый цикл получения копий ДНК включает три стадии:
плавление: реакционную смесь нагревают до 90–95°, ДНК денатурирует,
образуя одноцепочечные нити;
гибридизацию ДНК с праймерами: температуру снижают до 50–60° и
праймеры комплементарно связываются с нитями ДНК;
элонгациа: присоединение Taq- полимеразы к 3'-концам праймеров и
синтез ДНК в направлении от 5'- к 3'-концу комплементарно ДНК-мат-
рице.
Процесс автоматизирован, проводится в приборе —
циклизаторе
или ами-
плификаторе ДНК, который позволяет задавать нужное количество циклов и
оптимальные временные и температурные параметры. За 25–30 циклов синте-
зируется несколько миллионов копий (рис. 3.29).