Стр. 49 - А.Я.Николаев - Биологическая химия (2004)

Упрощенная HTML-версия

5 4
xIacTb I. Строение информационных молекул и матричные биосинтезы
задачу представляет измерение концентрации какого-либо индивидуального бел­
ка в сложной смеси белков. Такого рода методы основаны на специфичности вза­
имодействия белков с их природными лигандами или природными и синтетичес­
кими аналогами лигандов. Один из широко применяемых методов основан на вза­
имодействии белков со специфическими антителами (см. гл. 20).
ВЫДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ БЕЛКОВ
Процедура выделения какого-либо белка начинается с переведения белков ткани
в раствор. Для этого ткань измельчают и клетки разрушают с помощью специаль­
ных приборов — гомогенизаторов, или просто растиранием с песком. Нераство­
римые части ткани из гомогената осаждают центрифугированием. В надосадоч-
ной жидкости (экстракте) содержатся растворимые белки. Если выделяемый бе­
лок прочно связан с какими-либо клеточными структурами, его можно перевести
в раствор, обрабатывая гомогенат детергентами. В экстракте наряду с вещества­
ми небелковой природы присугствует много разных белков, причем искомый бе­
лок часто содержится в очень небольших количествах, составляющих десятые
доли процента от всех белков.
Главная трудность выделения индивидуального белка состоит именно в его
отделении от остальных белков. Все белки как соединения одного класса облада­
ют сходными свойствами, и их фракционирование основано на небольших разли­
чиях в свойствах разных белков. В процессе выделения по возможности избегают
денатурирующих воздействий: работ}’ проводят при температуре, близкой к 0 °С,
не применяют сильнокислых или сильнощелочных растворов.
Избирательная денатурация.
Многие белки денатурируются и выпадают в осадок
при нагревании раствора до 50-70 0C или при подкислении примерно до pH 5.
Если выделяемый белок выносит эти условия, то часть посторонних белков мож­
но удалить из раствора таким способом.
Различия в растворимости.
Чаще всего используют зависимость растворимости
белков от концентрации сульфата аммония. Если в раствор белков добавить не­
большое количество (NH4)9SO4 (например, 10 г на 100 мл раствора), то наименее
растворимые белки выпадут в осадок. Осадок отделяют центрифугированием, а к
надосадочной жидкости добавляют еще 10 г (NH4)2SO4и получают второй осадок.
Продолжая эту процедуру, получают ряд фракций; в одной из них содержание
искомого белка больше, чем в других. Сходным образом можно фракционировать
белки добавлением возрастающих количеств ацетона или спирта.
Различия в количестве и природе ионогенных групп.
Эти свойства позволяют фрак­
ционировать белки методами ионообменной хроматографии и электрофореза.
Для хроматографии белков применяют ионообменники на основе целлюло­
зы или других гидрофильных полимеров, например диэтиламиноэтилцеллюло-
зу (ДЭАЭ-целлюлоза), содержащую катионные группы, или карбоксиметилцел-
люлозу (КМ-целлюлоза), содержащую анионные группы (рис. 1.31).
Прочность связывания белков с ДЭАЭ-целлюлозой тем выше, чем больше в
молекуле белка карбоксильных групп. Белки, адсорбированные на ДЭАЭ-целлю-
лозе, можно смыть (элюировать) растворами с возрастающей концентрацией
NaCl: вначале элюируются слабо связывающиеся белки, а по мере увеличения